ヘビ毒には、カルボキシルエステル結合を加水分解する酵素が含まれています。加水分解の基質は、リン脂質、アセチルコリン、および芳香族酢酸塩です。これらの酵素には、ホスホリパーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、芳香族エステラーゼの 3 種類があります。ヘビ毒のアルギニンエステラーゼも合成アルギニンやリジンを加水分解できますが、自然界では主にタンパク質のペプチド結合を加水分解するため、プロテアーゼに属します。ここで説明する酵素はエステル基質にのみ作用し、ペプチド結合には作用しません。これらの酵素の中で、アセチルコリンエステラーゼとホスホリパーゼの生物学的機能はより重要であり、十分に研究されています。一部のヘビ毒は強い芳香族エステラーゼ活性を持ち、p-ニトロフェニル エチル エステル、α-または P-ナフタレン アセテート、およびインドール エチル エステルを加水分解できます。この活性が独立した酵素によって生成されるのか、それともカルボキシルエステラーゼの既知の副作用によって生成されるのかはまだ不明であり、その生物学的意義は言うまでもありません.Agkistrodon halys Japonicus の毒液を p-ニトロフェニル エチル エステルおよびインドール エチル エステルと反応させた場合、p-ニトロフェノールおよびインドール フェノールの加水分解物は検出されませんでした。逆に、これらのエステルがコブラ Zhoushan 亜種のヘビ毒および Bungarus multicinctus のヘビ毒と反応すると、それらは急速に加水分解されます。これらのコブラ毒は強いコリンエステラーゼ活性を持っていることが知られています。実際、マクリーン等。(1971) コブラ科に属する多くのヘビ毒は、インドール エチル エステル、ナフタレン エチル エステル、およびブチル ナフタレン エステルを加水分解できると報告しました。これらのヘビ毒は、コブラ、黒首コブラ、黒唇コブラ、ゴールデン コブラ、エジプト コブラ、キング コブラ、ゴールデン コブラ マンバ、ブラック マンバ、ホワイト リップド マンバに由来します
ヘビ毒は、血清中のコリンエステラーゼ活性を測定するための基質であるメチル インドール エチル エステルを加水分解できますが、このヘビ毒はコリンエステラーゼ活性を示しません。これは、コリンエステラーゼとは異なる未知のエステラーゼがコブラ毒に存在することを示しています。この酵素の性質を理解するには、さらなる分離作業が必要です。
1、ホスホリパーゼA2
(一) 概要
ホスホリパーゼはグリセリルリン酸を加水分解できる酵素です。自然界には、ホスホリパーゼA2とホスホリパーゼの5種類のホスホリパーゼがあります。
A.、ホスホリパーゼ B、ホスホリパーゼ C、およびホスホリパーゼ D。ヘビ毒には主にホスホリパーゼ A2 (PLA2) が含まれており、いくつかのヘビ毒にはホスホリパーゼ B が含まれており、他のホスホリパーゼは主に動物の組織や細菌に見られます。これらのホスホリパーゼの基質加水分解に対する作用部位を図3-11-4に示します。
ホスホリパーゼの中で、PLA2 はより研究されています。ヘビ毒で最も研究されている酵素かもしれません。その基質は、Sn-3-グリセロリン酸の 2 番目の位置にあるエステル結合です。この酵素は、ヘビ毒、ハチ毒、サソリ毒、および動物組織に広く見られ、PLA2 は 4 科のヘビ毒に豊富に含まれています。この酵素は赤血球を壊して溶血を起こすことから「溶血素」とも呼ばれています。PLA2 溶血性レシチナーゼと呼ぶ人もいます。
Ludeeke は、ヘビ毒が酵素を介してレシチンに作用することにより、溶血性化合物を生成できることを最初に発見しました。その後、Delezenne等。馬の血清や卵黄にコブラ毒が作用すると、溶血物質を生成することが証明されました。現在、PLA2 は赤血球膜のリン脂質に直接作用し、赤血球膜の構造を破壊して直接溶血を引き起こすことが知られています。また、血清または追加されたレシチンに作用して溶血性レシチンを生成し、赤血球に作用して間接溶血を生成します.PLA2 はヘビ毒の 4 つのファミリーに豊富に含まれていますが、さまざまなヘビ毒の酵素の含有量はわずかに異なります。ガラガラヘビ (C
ヘビ毒は弱い PLA2 活性しか示さなかった。表 3-11-11 は、中国の毒ヘビの主要な 10 毒の PLA2 活性の比較を示しています。
表3-11-11 中国におけるヘビ毒10種のホスホリパーゼVIII活性の比較
ヘビ毒
脂肪の放出
脂肪酸、
クジュモール/mg)
溶血活性 CHU50/^ g * ml)
ヘビ毒
脂肪酸を放出する
(^ラオール/mg)
溶血活性 "(HU50/ftg * 1111)
ナジャナジャ アトラ
9. 62
十一
ミクラセファル・オフィス
5.1 ゼロ
カリスパラス
8. 68
二千八百
グラシリス
V、アクトゥス
7. 56
* * #
オフィオファガス・ハンナ
スリーポイントエイトツー
百四十
ブヌガルス・ファスクタタス
7,56
二百八十
B. multicinctus
1.96
二百八十
Viper a russelli
セブン・ポイント・ゼロ・スリー
T、粘膜筋腫
1.8 5
シアメンシス
T.ステジネゲリ
0.97
（2）分離精製
ヘビ毒中のPLA2の含有量が多く、熱、酸、アルカリ、変性剤に対して安定であるため、PLA2の精製と分離が容易です。一般的な方法は、最初に粗毒液でゲルろ過を行い、次にイオン交換クロマトグラフィーを行い、次のステップを繰り返すことができます。イオン交換クロマトグラフィー後のPLA2の凍結乾燥は、PLA2の凝集を引き起こす重要な要因であるシステム内のイオン強度を凍結乾燥プロセスがしばしば増加させるため、凝集を引き起こしてはならないことに注意する必要があります。上記の一般的な方法に加えて、次の方法も採用されています。②PLA2の基質類似体をアフィニティークロマトグラフィーのリガンドとして使用した。このリガンドは、Ca2+ でヘビ毒の PLA2 に結合できます。EDTA は主に溶離液として使用されます。Ca2+ が除去されると、PLA2 とリガンド間の親和性が低下し、リガンドから解離する可能性があります。30% 有機溶液または 6mol/L 尿素を溶離液として使用するものもあります。③ PheiiylSephar0SeCL-4B を用いて疎水クロマトグラフィーを行い、心毒素中の微量 PLA2 を除去した。④抗PLA2抗体をリガンドとしてPLA2のアフィニティークロマトグラフィーを行った。
これまでに多数の蛇毒PLAZが精製されています。Tuら。(1977) は、1975 年以前にヘビ毒から精製された PLA2 をリストアップしました。近年、PLA2 の分離と精製に関する多数の論文が毎年報告されています。ここでは、中国の学者による PLA の分離と精製に焦点を当てます。
チェン・ユアンコン 他(1981) 浙江省の Agkistrodon halys Pallas の毒から 3 つの PLA2 種を分離し、等電点に従って酸性、中性、およびアルカリ性の PLA2 に分けることができます。その毒性によると、中性PLA2はより毒性が高く、シナプス前神経毒アグキストロドトキシンとして同定されています。アルカリ性 PLA2 は毒性が低く、酸性 PLA2 は毒性がほとんどありません。ウー・シャンフー 他(1984) 分子量、アミノ酸組成、N 末端、等電点、熱安定性、酵素活性、毒性、および溶血活性を含む 3 つの PLA2 の特性を比較しました。その結果、分子量と熱安定性は類似していましたが、他の面では大きな違いがありました。酵素活性の面では、酸性酵素活性はアルカリ性酵素活性よりも高かった。ラット赤血球に対する溶血作用はアルカリ酵素が最も強く、続いて中性酵素、酸性酵素はほとんど溶血しませんでした。したがって、PLAZ の溶血効果は PLA2 分子の電荷に関連していると推測されます。張景康 他(1981) アグキストロドトキシンの結晶を作りました。Tu Guangliang ら。(1983) 等電点が 7.6 の有毒な PLA が福建省の Vipera rotundus の毒液から分離および精製されたこと、およびその物理的および化学的特性、アミノ酸組成、および N 部位の 22 アミノ酸残基の配列が報告されました。端末が決定しました。Li Yuesheng ら。( 1985 ) 福建省のViper rotundusの毒液から別のPLA2を分離し、精製しました。ＰＬＡ２ ＊ のサブユニットは１３８００であり、等電点は１０．４であり、酵素の最適ｐＨは８．０であり、最適温度は６５℃である。マウスに静脈内注射されたＬＤ５。0.5±0.12mg/kgです。この酵素には明らかな抗凝固作用と溶血作用があります。毒性のある PLA2 分子は、18 種類のアミノ酸の 123 残基から構成されています。この分子は、システイン (14)、アスパラギン酸 (14)、およびグリシン (12) が豊富ですが、メチオニンは 1 つしか含まず、その N 末端はセリン残基です。Tuguang によって分離された PLA2 と比較すると、2 つのアイソザイムの分子量とアミノ酸残基の数は非常に類似しており、アミノ酸組成も非常に類似していますが、アスパラギン酸とプロリン残基の数は多少異なります。広西キングコブラのヘビ毒には、PLA2が豊富に含まれています。シュウ・ユヤン 他(1989) 毒から PLA2 を分離しました。これは、元の毒よりも 3.6 倍高い比活性、13000 の分子量、122 のアミノ酸残基の組成、8.9 の等電点、および良好な熱安定性を持っています。塩基性PLA2の赤血球への影響を電子顕微鏡で観察すると、ヒトの赤血球膜には明らかな影響がありますが、ヤギの赤血球には明らかな影響がないことがわかります。このPLA2は、ヒト、ヤギ、ウサギ、モルモットの赤血球の電気泳動速度に明らかな遅延効果をもたらします。チェン等。この酵素は、ADP、コラーゲン、およびアラキドン酸ナトリウムによって誘発される血小板凝集を阻害することができます。ＰＬＡ２濃度が１０μｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌの場合、血小板凝集は完全に阻害される。洗浄血小板を材料とした場合、PLA2は20Mg/mlの濃度で凝集を阻害できなかった。アスピリンはシクロオキシゲナーゼの阻害剤であり、血小板に対するPLA2の効果を阻害することができます。PLA2 は、アラキドン酸を加水分解してトロンボキサン A2 を合成することにより、血小板凝集を阻害する可能性があります。浙江省のアマガサヘビ毒によって生産された PLA2 の溶液コンフォメーションは、円偏光二色性、蛍光、および UV 吸収によって研究されました。実験結果は、この酵素の主鎖コンフォメーションが他の種および属からの同種の酵素のそれと類似していること、骨格コンフォメーションが良好な耐熱性を有すること、および酸性環境における構造変化が可逆的であることを示した。活性化剤 Ca2+ と酵素の組み合わせは、トリプトファン残基の環境に影響を与えませんが、阻害剤 Zn2+ は反対のことをします。溶液のpH値が酵素活性に影響を与える方法は、上記の試薬とは異なります。
ヘビ毒の PLA2 精製の過程で明らかな現象は、ヘビ毒が 2 つ以上の PLA2 溶出ピークを含むことです。この現象は次のように説明できます。①アイソザイムの存在による。② 1 種類の PLA2 を重合して、さまざまな分子量のさまざまな PLA2 混合物を生成します。そのほとんどは 9 000 ～ 40 000 の範囲です。③ PLA2 と他のヘビ毒成分の組み合わせは、PLA2 を複雑にします。④PLA2のアミド結合が加水分解されるため、電荷が変化します。①と②は一般的ですが、CrWa/w ヘビ毒の PLA2 など、いくつかの例外があります。
①と②の2つの状況があります。3 番目の状態は、次のヘビの毒液の PLA2 で発見されました: Oxyranus scutellatus、Parademansia microlepidota、Bothrops a^>er、Palestinian viper、sand viper、およびひどいガラガラヘビ km。
ケース④の結果は、電気泳動中にPLA2の移動速度が変化しますが、アミノ酸組成は変化しません。ペプチドは加水分解によって切断されることがありますが、通常はジスルフィド結合によって結合されたままです。東部ガラガラヘビの毒には、それぞれ a 型と p 型 PLA2 と呼ばれる 2 種類の PLA2 が含まれています。これら 2 種類の PLA2 の違いは、1 つのアミノ酸だけです。つまり、一方の PLA2 分子のグルタミンが、もう一方の PLA2 分子のグルタミン酸に置き換えられています。この違いの正確な理由は明らかではありませんが、PLA2 の脱アミノ化に関連していると一般的に考えられています。パレスチナのマムシ毒液中のPLA2を粗毒液で保温すると、その酵素分子の末端基は以前より多くなります。Cからヘビ毒から分離されたPLA2は2つの異なるN末端を持ち、その分子量は30000です。この現象は、東部のガラガラヘビの毒でPLA2によって形成される対称二量体と同様に、PLA2の非対称二量体によって引き起こされる可能性がありますとニシダイヤガラガラヘビ。アジアのコブラは多くの亜種で構成されており、そのうちのいくつかは分類があまり明確ではありません.たとえば、以前はコブラの外カスピ海亜種と呼ばれていたものが現在認識されています
それは外カスピ海コブラに起因するはずです。多くの亜種があり、それらが混ざり合っているため、ヘビ毒の組成はさまざまなソースによって大きく異なり、PLA2 アイソザイムの含有量も高くなります。たとえば、コブラの毒
r^ll 種の PLA2 アイソザイムは少なくとも 9 種類、コブラ亜種 Caspian の毒液には 7 種類の PLA2 アイソザイムが見出された。ダーキン等。( 1981 ) 18のコブラ毒、3つのマンバ毒、5つのマムシ毒、16のガラガラヘビ毒、および3つのウミヘビ毒を含む、異なるヘビ毒におけるPLA2含有量およびアイソザイムの数を研究した.一般に、コブラ毒の PLA2 活性は高く、多くのアイソザイムがあります。マムシ毒のPLA2活性とアイソザイムは中程度です。マンバ毒とガラガラヘビ毒の PLA2 活性は、PLA2 活性が非常に低いか、まったくない。ウミヘビ毒の PLA2 活性も低い。
近年、ヘビ毒中の PLA2 が、東部の rhombophora ガラガラヘビなどの活性な二量体の形で存在することは報告されていません (C. ヘビ毒には、2 つの同一のサブユニットで構成される a 型と P 型の PLA2 が含まれています。 、そしてジメラーゼのみが持っています
アクティビティ。シェン等。また、ヘビ毒のPLA2の二量体のみが酵素の活性型であることも提案しました。空間構造の研究は、ニシダイヤガラガラヘビの PLA2 が二量体の形で存在することも証明しています。魚食性化合物
ヘビ毒にはPLA ^ EiとE2の2種類があり、仏は二量体の形で存在し、二量体は活性、その解離した単量体は不活性です。呂英華ら。( 1980 ) さらに、E. Jayanthi らの物理的および化学的性質と反応動力学を研究しました。( 1989 ) 毒蛇毒から基本的なPLA2 (VRVPL-V)を分離しました。モノマー PLA2 の分子量は 10000 で、致死、抗凝固、浮腫の効果があります。この酵素は、PH 4.8 の条件下で異なる分子量のポリマーを重合することができ、ポリマーの重合度と分子量は温度の上昇とともに増加します。96°Cで生成されたポリマーの分子量は53100で、このポリマーのPLA2活性は2倍になります
投稿時間: 2022 年 11 月 18 日